Real Time PCR 3

Temperature Melting
دمایی که در آن 50% از DNA بشکل دناتوره شده می باشد را Tm یا دمای ذوب گویند.

اگر دیمرهای پرایمر ایجاد شده باشند، در منحنی ملتینگ 2 تا peak دیده می شود:
- یکی پیک مخصوص تکثیره شده ما
- دیگری پیک ملتینگی که ازدیمر های پرایمر بوجود آمدند.
اگر تنها یک پیک داشته باشم، مربوط می شود به محصول اختصاصی.
اما اگر 2 تا پیک داشته باشم، می تواند مربوط به حضور محصول غیر اختصاصی یا دیمرهای پرایمر باشند.

200612805529_specific.jpg
200612805555_non%20specific.jpg
لازم به تذکر هست که اگر دارای 2 تا پیک باشیم (منحنی قرمز در شکل)، پیک اختصاصی نسبت به مواردی که تنها یک پیک داریم (منحنی سبز و بنفش)،کوتاهتر خواهد بود .
اما در منحنی سیاه تنها محصول غیر اختصاصی ایجاد می شود. دلیل آن هم بخاطر این است که هرگاه محصول غیر اختصاصی ایجاد می شود، محصول اختصاصی کم تشکیل می شود.

منحنی ملتینگ برای استفاده از Real Time با SYBR Green نیاز است.
SYBER Green اینتر کالانت غیر اختصاصی هست که به کل DNAds متصل می شود، در نتیجه اگر دارای ناخالصی باشیم، به ما یک سیگنال ترکیبی بغیر از نمونه مورد استفاده می دهد که قابل تشخیص نیست.
آنچه که برای اندازه گیری فلورسانت با بالا رفتن دما انجام می شود ، نتیجه اش این گرافیک است.

Image82.gif
که می تواند برای آسانی کار به گرافیک زیر تبدیل بشود.

Image81.gif

توجه :
اگر دمای دناتوره کردن DNA خیلی بالا باشد، خطر از دست دادن فلورسانت هم وجود دارد، چراکه SYBER Green در غیاب DNAds فلورسان نمی کند.
هرگاه تمام نمونه ها همان Tm را داشته باشند، می توانیم تکثیر شدهای غیر اختصاصی را در نظر نگیریم، در غیر اینصورت پیک های دیگری را خواهند داد.

اپرون

/ 2 نظر / 58 بازدید
محمدرضاگرامی

با سلام از اظهار لطفی که داشتيد ممنونم .... اميدوارم که هميشه موفق باشيد (به وبلاگ شما لينک داده شد)

sm

با سلام بابت توضیحات کاربردی شما بسیار تشکر استفاده کردم موفق باشین